弊社はCBGの訴求方法の中に、「非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に対しての有益である可能性」を提示している。この根拠を示すため、以下の論文を紹介する。

研究内容

本研究では、メチオニン/コリン欠乏餌（MCD; よく引用されるNASH動物モデル）、およびそれに対応するコントロール（CTR; 表1）を用いて、CBGの補充がNASHの主要な病理学的特徴である肝脂肪蓄積、炎症、および線維症に与える影響の調査を目的とする。

方法

8週齢の雄性C57BL/6マウス（n = 36）を使用しました。マウスはランダムにCTR群（n = 18）、MCD群（n = 18）に割り当てられ、CTR餌またはMCD餌を5週間摂取しました。

第4週の初めに、3つのサブグループに無作為に分けられ、腹腔内（I.P.）注射により、薬剤（2.5%ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水）またはCBGの低用量（2.46 mg/kg/day, L. CBG）または高用量（24.6 mg/kg/day, H. CBG）を週に3回、2週間投与しました。

H. CBG処理を準備するために、6.642 mgの無水CBGをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらに1.5 mLのリン酸緩衝塩液（PBS）に溶解しました。低用量CBG処理は、H. CBGの1/10です。コントロール処理は、CBGを除いた高用量CBGと同様の方法で準備されました。

表1 メチオニン/コリン欠乏餌、コントロール餌の組成

 

測定指標

肝臓全体の健康状態、脂肪肝、肝臓の炎症を評価した。

 

結果

低用量のCBG処理がC57BL/6マウスのMCD餌誘発性のNASH症状を軽減した。

図1 （A）群間の形態の違いを説明するための収穫後の肝臓の代表的な画像。（B）平均総食事量。（C）体重。（D）および平均肝臓重量対体重比。（E）H&Eで染色した後の肝臓の表現。MCD食（下段）で脂質の蓄積（肝バルーン部にアスタリスクのマーク）、白血球の浸潤（拡大部）を示す。

 

CBG処理を受けていないMCDダイエットを摂取したマウスの肝臓は色が薄く、サイズが小さく見えました。それに対して、低用量のCBG処理後のMCD群では肝臓の形態が大幅に改善されました（図1A）。

 

すべての群間で食物摂取量には有意な変化は観察されませんでしたが、MCD群では他の群と比較して食物摂取量が少ない傾向がありました（図1B）。

 

MCD群の全体的な体重は、CTR餌を摂取したマウスと比較して有意に低かった（図1C）。

 

肝臓重量と体重の比率は、CBG処理を受けていないMCD群で有意に増加し、低用量のCBG処理で正常化されました。興味深いことに、高用量のCBG処理はMCD単独処理からの肝臓の健康状態の改善を示さなかった（図1D）。

 

CTR群では有意な損傷は示されませんでしたが、MCD単独のマウスでは肝臓の膨張と炎症の部位が観察されました。

肝臓の膨張と白血球の浸潤はMCD L.CBGグループでは軽減されましたが、MCD H.CBGグループでは軽減効果はそれほど顕著ではありませんでした（図1E）。

 

 

CBG処理はMCD餌によって引き起こされる脂肪肝には影響を与えなかった。

図2 （A）Bodipy（緑）、およびDAPI（青）の免疫蛍光染色（20×）。（B）免疫蛍光染色はImageJを用いて定量化した。（C）CD36のmRNA発現。（D）トリグリセリドの割合は市販のELISAキットを用いて評価した。

 

すべてのMCD群で脂質の蓄積が増加していることがわかりましたが、CBGはMCD L.CBGグループやMCD H.CBGグループの脂質量を減少させることはできませんでした（図2A,B）

 

CD36はNASHの広く使用されるバイオマーカーであり、脂質の細胞内への転送に関与しています。RT-qPCRを使用してCD36の遺伝子発現を測定しました。

 

MCD群ではCTR群と比較して肝臓でCD36の遺伝子発現が増加しており、これはBodipy染色と一致しています。しかし、異なるMCD群間で有意な差は見られませんでした（図2C）。

 

トリグリセリド血症は、非症状のNAFLDおよびNASH患者のスクリーニングに広く使用されています。したがって、商業的に利用可能なELISA（酵素連結免疫測定）キットを使用してトリグリセリドレベルを測定しました。

 

予想通り、MCDダイエットグループの肝臓組織でトリグリセリドレベルがCTRグループと比較して増加していました。CD36の発現と一致して、各ダイエット内のCBGサブグループ間には有意な差はありませんでした（図2D）。

 

低用量のCBGにより肝炎が軽減される一方、高用量のCBGは肝組織の炎症を増強した。

図3 （A）白血球を示すCD45を赤色、DAPIを青色で染色した肝組織の凍結切片の代表的なイメージ（20×）。（B）免疫蛍光染色はImageJを用いて定量化した。（C）マクロファージ（F4/80+）の浸潤は赤色で表示され、DAPI染色により核が青色で表示された。（D）F4/80のイメージもImageJを使用して定量化された。（E）F4/80のmRNA発現の定量化。

 

増強された肝炎はNASHの特徴の1つであり、NASHを治療するための潜在的なターゲットは炎症を軽減することです。CBGは他の疾患において抗炎症効果を示しています。したがって、MCD誘導性NASHマウスモデルでのCBGの抗炎症効果を評価しました。

 

まず、白血球のマーカーであるCD45に対する免疫蛍光染色を使用して肝炎を測定した（図3A, B）。予想通り、MCDダイエットを受けたマウスでは白血球（CD45+）の浸潤が増加したが、低用量のCBGはMCDダイエットを受けたマウスの白血球の浸潤を有意に軽減した。しかし、高用量のCBGはMCDダイエットを受けたマウスの白血球の浸潤を軽減しなかった。

 

実際、高用量のCBGで治療されたグループでは、免疫細胞の増殖がMCDダイエットのみで治療されたグループと同様のレベルを示した（図3A, B）。

 

マクロファージはNASHの病態進展における重要な調節因子であることが示されています。マクロファージの浸潤の阻害は、NASH関連の線維症の緩和につながります。図3A、BのCD45+染色と同様に、低用量のCBGはMCD餌によって引き起こされるマクロファージ集団（マクロファージマーカーであるF4/80+）を減少させました。一方、高用量のCBGはMCDダイエットを受けたマウスのマクロファージ集団を減少させませんでした（図3C、D）。

 

MCD H.CBG群では、CTR群およびMCD群と比較して、F4/80のmRNAレベルに有意な増加が見られました。しかし、低用量のCBG処理では、MCDマウスのF4/80のmRNAレベルに変化は観察されませんでした（図3E）。

 

 

低用量のCBGは肝線維症を改善し、高用量のCBGは肝線維症を増加させた。図3 肝線維化は、Picro-Sirius Red染色、α-SMA染色、mRNA遺伝子発現により測定した。（A, B）肝臓凍結切片のコラーゲン沈着の代表写真と定量化（10×）。（C, D）α-SMAを赤、DAPI（核）を青で示したα-SMA免疫蛍光染色と定量化（20×）。（E）α-SMA mRNA遺伝子発現の定量化。

 

NASHのもう一つの主な病理的特徴は、慢性炎症による肝線維症です。慢性脂肪肝は炎症と持続的な線維症を誘発し、肝機能の制限を引き起こすことがあります。したがって、肝線維症は肝臓組織中のコラーゲンを染色するPicro-Sirius Red染色を用いて評価されました。

 

MCD L.CBG群では、MCDのみの群と比較してコラーゲンの沈着が有意に減少しました（図4A,B）。CTR H.CBG群およびMCD H.CBG群では、CTR群と比較してコラーゲンの沈着が有意に増加しました。

 

これらの結果は、alpha smooth muscle actin（α-SMA）で染色された凍結肝切片を用いても確認されました（図4C,D）。

 

同様に、α-SMAのmRNA遺伝子発現は、MCDと比較して低用量のCBG処理によってα-SMAの発現が減少したことを示しました（図4E）。

結論

CBGの低用量投与は、MCD誘発NASHの肝線維化および炎症を緩和したが、CBG高用量投与は、MCDのみ投与群と比較して、肝障害が増強されたことが示された。

青い背景の文章は以下の論文から引用